第一部分 类人胶原蛋白简介
第二部分 类人胶原蛋白的创新性
第三部分 类人胶原蛋白已完成的实验研究
第四部分 类人胶原蛋白在美容医学方面的应用

第一部分 类人胶原蛋白简介
类人胶原蛋白是是将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA，并经过体外修饰（主要是将胶原蛋白两端的免疫源端肽去掉，进一步降低其免疫排异反应）后，重组于大肠杆菌内，经过高密度发酵、分离、纯化等工艺生产的一种水溶性高分子生物蛋白。类人胶原蛋白结构与Ⅲ型比较接近，但氨基酸组成与Ⅰ型相近，为三螺旋重复结构（动物胶原蛋白为三交叉螺旋结构）。

图1.1 类人胶原蛋白的三螺旋结构示意图

第二部分 类人胶原蛋白的创新性
类人胶原蛋白具有胶原蛋白的基本功能，如：生物兼容性、生物吸收性、细胞粘附性、促新细胞形成和促上皮细胞形成等等。相比于其它类型的胶原蛋白，类人胶原蛋白具有以下几点创新性：

1. 可加工性：该重组类人胶原蛋白不仅具有胶原蛋白原有功效，如：生物兼容性、生物吸收性、细胞粘附性、促新细胞形成和促上皮细胞形成，而且由于它的三重复螺旋结构，赋予其更新的功能，可广泛用于制备人工皮肤、止血海绵等医用材料；
2. 水溶性：该重组技术生产的类人胶原蛋白为水溶性蛋白，这一特性是该产品的另一竞争优势.它区别于水解性胶原蛋白，水解性胶原蛋白是从动物组织中提取的胶原蛋白经水解工艺而生成的分子量在5000道尔顿左右的小分子胶原肽，无论用作皮肤的网状支撑还是手术缝线，分子量太小是无法实现此功能的。国内的从动物组织提取的水溶性胶原蛋白其实质是小分子胶原肽。国外的粉末状的胶原蛋白也是如此。真正的来自动物组织的结构未被破坏的胶原蛋白只溶解于酸或碱中，无法直接应用于人体皮肤， 而类人胶原蛋白是精细纤维状的水溶性的冻干品，研究证明，类人胶原蛋白是以单螺旋的线性结构形式溶解于水溶液中，分子量为9万道尔顿，能增强对皮肤的渗透和吸收；
3. 无病毒隐患：由于从动物组织中提取的胶原蛋白固有的交叉结构弱点及病毒隐患的致命缺点，直接限制了其用途的开发，而类人胶原蛋白则弥补了此缺点，作为生物材料它可广泛用于医疗行业等，从而拓宽了它可开发的用途；
4. 低排异反应：类人胶原蛋白与人体自身胶原蛋白同根同源，结构极为类似，易于吸收；同时它又去掉了免疫源端肽，免疫排异反应极低；
5. 酸碱度pH值为6.5-7.5，为中性，不会破坏皮肤本身酸碱平衡；
6. 动物胶原蛋白的变性温度为37℃-40℃， 而类人胶原蛋白的变性温度达72℃以上，所以易于日常使用和利于生产生物医学材料。

第三部分 类人胶原蛋白已完成的实验研究
一、生物学评价实验：
1、全身毒性试验
2、细胞毒性实验
3、皮肤刺激实验
4、皮肤过敏实验
5、类人胶原蛋白促细胞形成实验（促进纤维细胞和表皮细胞生长，促进速度1.4~1.6倍）
6、植入实验评价（小白鼠皮下），90天无炎症和不良反应。
7、亚慢性毒性试验
8、热原试验
9、类人胶原蛋白止血海绵止血效果的对比实验：能在10秒内有效止血，比动物胶原蛋白促进伤口愈合速度快1.4-1.6倍。

二、类人胶原蛋白应用皮肤的相关实验
1、类人胶原蛋白保湿效果实验
天然保湿因子、透明质酸、吡咯烷酮羧酸钠是目前中高档化妆品中常用的保湿剂。为考察类人胶原蛋白的保湿效果，在相同的条件下，比较1%天然保湿因子（NMF-50）、1%透明质酸（HA）、1%类人胶原蛋白、1%吡咯烷酮羧酸钠（PCA-钠）的保水率，结果是类人胶原蛋白的保湿效果最好。
四种保湿剂的保水率

2、类人胶原蛋白透皮吸收实验
将小白鼠随机分成3组，空白组3只，另外两组每组6只。3组分别为空白组、明胶组和类人胶原蛋白组。于试验前24小时在小鼠背部使用作用温和的脱毛剂脱毛备皮，形成3cm×3 cm大小的去毛区，脱毛时要轻柔，避免对皮肤造成损伤。试验时，首先用生理盐水对去毛区进行清洁，然后使用棉签涂抹荧光染料标记过的明胶和类人胶原蛋白溶液，空白对照组只进行清洁，不作其它处理。涂抹试样后在皮肤表面水分干燥后（几分钟）处死小白鼠，在涂抹试样区域取1cm×2cm大小的皮肤，首次取样。4h，8h分别进行第二、三取样，最后一次还要取空白对照组，进行冰冻切片，荧光显微镜观察。

图3.2.1 明胶溶液涂抹4h后荧光照片	图3.2.2 明胶溶液涂抹8小时后荧光照片

图3.2.3 类人胶原蛋白溶液涂抹4hr后荧光照片	图3.2.4 类人胶原溶液涂抹8h后荧光照片

冰冻切片结果显示首次取样的明胶组和类人胶原蛋白组荧光物质存在于皮肤表面，而第二次或第三次取样的类人胶原蛋白组荧光物质有一部分分布在毛囊或者真皮层，而明胶组依然只在皮肤表面有荧光物质。表明类人胶原蛋白具有较强的透皮吸收行为。

三、类人胶原蛋白细胞学实验
1、类人胶原蛋白促成纤维细胞和上皮细胞生长实验
0.1%类人胶原蛋白可促进成纤维细胞和上皮细胞的生长，其作用明显优于0.1%的维生素C和0.1%的明胶。

图3.3.1 类人胶原蛋白促细胞生长实验

2、与细胞的亲和性试验
将类人胶原蛋白海绵在超净工作台剪成略小于6孔板单孔大小的圆片，放入6孔板内，加入预热好的细胞培养液，接种细胞，接种密度为3×105cells/ml，放入二氧化碳培养箱进行培养，24小时观察一次并换液，向培养7d的6孔板中每孔加入40μL的荧光染料CFDA母液，在二氧化碳培养箱内孵育20min，根据CFDA的激发波长485nm，发射波长530nm，选择合适的滤光片，进行荧光显微镜观察；14天时取出海绵立即固定、脱水、干燥并镀膜后扫瞄电子显微镜观察并拍照。

图3.3.2 类人胶原蛋白海绵表面2BS培养14天后扫描电镜观察	图3.3.3 类人胶原蛋白海绵表面2BS培养14天后CFDA染色观察

本实验采用CFDA对细胞进行荧光染色，观察细胞的存活情况；扫描电镜观察细胞生长、增殖、形态结构。根据荧光照片和电镜照片我们明显可以看出，14天时成纤维细胞大量贴附在类人胶原蛋白海绵表面，且生长良好。反映了类人胶原蛋白具有良好的细胞亲和性。

四、类人胶原蛋白组织相容性实验：
将类人胶原蛋白海绵、某品牌胶原蛋白海绵和某品牌可吸收明胶海绵分别植入兔子肝脏，在4周时处死实验兔，开腹观察海绵植入处的肝组织，肉眼观察海绵的降解吸收情况及有无病变，并取植入处肝组织作HE染色和透射电镜观察。以通过肝组织形态变化和肝细胞的显微结构改变来确定三种生物医学材料的肝组织相容性。

图3.4.1 类人胶原蛋白海绵植入4周(HE×100)	图3.4.2 类人胶原蛋白海绵植入4周 (HE×400)

图3.4.3 类人胶原蛋白海绵植入4周(TEM)	图3.4.4 类人胶原蛋白海绵植入4周(TEM)

图3.4.5 某品牌胶原蛋白海绵植入4周(HE×100)	图3.4.6 某品牌胶原蛋白海绵植入4周(HE×400)

图3.4.7 某品牌胶原蛋白海绵植入4周(TEM)	图3.4.8某品牌胶原蛋白海绵植入4周(TEM)

病理分析（HE染色）和TEM分析最能直观的反映材料的生物相容性，通过图片分析，可以看到：4周时所有供试海绵均基本降解，但是某品牌的胶原蛋白海绵和可吸收明胶海绵造成植入处肝细胞水肿变性，或者细胞核收缩，细胞器形态和数量都有不同程度的改变，不易染色。类人胶原蛋白止血海绵对植入处肝细胞形态几乎不造成影响，细胞器的形态也较好，预示组织相容性良好。

五、类人胶原蛋白止血海绵肝脏止血实验
将类人胶原蛋白止血海绵、某品牌胶原蛋白海绵、某品牌可吸收明胶海绵和某品牌可降解纱布分别敷压在兔肝脏创面，记录完全止血时间，观察几种止血材料在创面的粘附情况并对肝脏表面进行拍照。

图3.5.1 敷压可吸收明胶海绵止血效果	图3.5.2 敷压可吸收纱布止血效果

图3.5.3 敷压类人胶原蛋白止血海绵止血效果	图3.5.4 敷压某品牌胶原蛋白海绵止血效果

某品牌胶原蛋白海绵对肝脏创面的完全止血时间为95秒，某品牌可吸收明胶海绵为110秒，某品牌可降解纱布为68秒；而类人胶原蛋白止血海绵为51秒，明显优于目前市场销售的同类产品。

图3.5.5某品牌胶原蛋白海绵止血后四周肝组织图片	图3.5.6类人胶原蛋白海绵止血后四周肝组织图片

四周后，对植入处肝组织进行观察，明胶海绵组引起较为严重的组织增生，肝组织肿胀明显；而类人胶原蛋白海绵组海绵吸收完全，创面恢复好，肝组织正常。验证了类人胶原蛋白系列生物医用材料良好的组织相容性。

第四部分 类人胶原蛋白在美容医学方面的应用
一、类人胶原蛋白在美容医学方面的特性
1、补充并刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白
与人体皮肤相容性优越，透皮吸收明显，可以给予皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增进血液循环。
2、对皮肤组织的修复作用
类人胶原蛋白促细胞生长速度促进纤维细胞和表皮细胞生长，促进速度1.4~1.6倍，并且和周围组织的亲合性好，具有修复组织的作用。
3、止血作用明显，组织细胞吸收性强
由于胶原蛋白分子中与动物细胞有很好的亲和性，使之具有了良好的止血和修复功效，能够快速止血和修复器官组织的目的。

二、类人胶原蛋白在美容医学方面的应用
前期多项研究实验表明，类人胶原蛋在促进纤维细胞和表皮细胞生长、止血、透皮吸收、保湿效果、生物相容性等方面，都明显优越于同类产品。
因此可广泛应用于医学美容领域的皮肤祛皱、痤疮、疾病或外伤引起的凹陷性瘢痕、皮肤红血丝症，及皮肤萎缩，皮内、皮下组织受损或其他软组织缺损的填充；激光、光子、磨削、拉皮等术后以及晒伤、灼伤等皮肤损伤的修复与养护等等，多项美容医学方面，也可以作为肌肤的‘能量’补充，抗衰老，日常保养使用。
大量的动物学、医学临床实验和应用实验表明，类人胶原蛋白在医学美容、整形外科、生活美容以及止血、烧伤、激光修复等领域有很广泛的前景和巨大的使用价值。

类人胶原复合止血膜	类人胶原止血海绵
类人胶原人工血管	类人胶原蛋白喷雾（可丽金胶原蛋白喷雾）